llumina二代測(cè)序技術(shù)，邊合成邊測(cè)序（SBS），是廣泛采用的新一代測(cè)序（NGS）技術(shù)，負(fù)責(zé)產(chǎn)生世界上90％以上的測(cè)序數(shù)據(jù)。

Illumina的二代測(cè)序技術(shù)稱為邊合成邊測(cè)序(Sequencing-by-Synthesis,簡(jiǎn)稱SBS)。SBS主要包括堿基延伸、熒光激發(fā)及信號(hào)收集、剪切等3個(gè)步驟。這3個(gè)步驟可以重復(fù)，循環(huán)進(jìn)行。每循環(huán)一次測(cè)定一個(gè)堿基。想測(cè)定多少個(gè)堿基（即讀長(zhǎng)），就循環(huán)多少次。測(cè)序循環(huán)次數(shù)可以在軟件里設(shè)定。到底測(cè)序多長(zhǎng)合適，要根據(jù)項(xiàng)目性質(zhì)和需求來決定。大多數(shù)情況下，SR實(shí)驗(yàn)（單端測(cè)序）測(cè)定1x50個(gè)堿基，PE實(shí)驗(yàn)（雙端測(cè)序）測(cè)定2x150個(gè)堿基。

1 堿基延伸

Illumina測(cè)序試劑里所使用的dNTP特色，它們同時(shí)具有兩個(gè)修飾基團(tuán)：一個(gè)熒光基團(tuán)，一個(gè)可逆終止基團(tuán)。A、G、C、T 4種堿基分別標(biāo)記4種不同的熒光基團(tuán)，它們?cè)诓煌ㄩL(zhǎng)的激光激發(fā)下，能夠發(fā)射不同波長(zhǎng)（即顏色）的熒光。熒光顏色與堿基種類一一對(duì)應(yīng)，因此根據(jù)激發(fā)光的波長(zhǎng)可以識(shí)別堿基。4種堿基的終止基團(tuán)是一樣的。由于終止基團(tuán)的存在，所有dNTP每次都只能延伸1個(gè)堿基，無論給予多長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間。又由于該終止基團(tuán)是可逆的，在熒光信號(hào)收集完畢之后，可以用剪切劑切除該終止基團(tuán)，使堿基恢復(fù)自然的可延伸狀態(tài)，這時(shí)即可繼續(xù)進(jìn)行下一輪循環(huán)，再測(cè)定一個(gè)堿基。

可逆終止基團(tuán)技術(shù)是Illumina二代測(cè)序的一大特色。它與橋式PCR技術(shù)一起，構(gòu)成了Illumina二代測(cè)序的兩大支柱，為穩(wěn)定獲得高質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

2 信號(hào)采集

HiSeq系列測(cè)序儀具有紅綠兩根激光管，兩個(gè)濾色片。它們兩兩組合，可以形成4種不同的激發(fā)波長(zhǎng)，正好分別用于激發(fā)A、G、C、T 4種堿基。

Cluster上所標(biāo)記的熒光基團(tuán)在激光激發(fā)下產(chǎn)生的信號(hào)，可以用相機(jī)拍攝或者掃描的方式收集信號(hào)。掃描技術(shù)速度比較快，被X10系列采用。由于FC面積比較大，而且上表面和下表面要分別拍照，所以拍照過程相當(dāng)耗時(shí)。對(duì)于經(jīng)典的HiSeq 2000來說，一次測(cè)序循環(huán)所產(chǎn)生的熒光信號(hào)，需要大約40分鐘的時(shí)間才能拍照收集完畢，時(shí)間比測(cè)序反應(yīng)本身還要長(zhǎng)。

3 剪切

熒光信號(hào)收集完畢后，關(guān)閉激光，用剪切劑去除測(cè)序引物的延伸產(chǎn)物上的堿基所標(biāo)記的熒光基團(tuán)和終止基團(tuán)。兩個(gè)修飾基團(tuán)均被切除，一方面消去干擾熒光，一方面使鏈末端的堿基回復(fù)到自然的可延伸狀態(tài)，為下一輪測(cè)序做好準(zhǔn)備。

再重復(fù)合成、激發(fā)、收集等步驟，即可進(jìn)行第二個(gè)堿基的測(cè)序。

測(cè)序循環(huán)可以重復(fù)多次。理論上可以一直重復(fù)，直到信噪比降低得無法有效識(shí)別堿基信號(hào)為止。由于熒光基團(tuán)的發(fā)光效率持續(xù)不斷在衰減，Taq酶的活性也在持續(xù)不斷地衰減，所以實(shí)際上測(cè)序循環(huán)次數(shù)是有限的，大重復(fù)次數(shù)與sbs試劑的配方有關(guān)。測(cè)序的循環(huán)次數(shù)可以在軟件設(shè)置過程中人為，這個(gè)重復(fù)次數(shù)就是每個(gè)測(cè)序片段的讀長(zhǎng)。目前，Illumina平臺(tái)的讀長(zhǎng)有2x100 bp，2x125 bp，2x150 bp，2x300 bp等多種，其中2x150 bp用得較廣泛。

單端測(cè)序：?jiǎn)味藴y(cè)序(Single-read)首先將DNA樣本進(jìn)行片段化處理形成200-500bp的片段，引物序列連接到DNA片段的一端，然后末端加上接頭，將片段固定在flow cell上生成DNA簇，上機(jī)測(cè)序單端讀取序列。

雙端測(cè)序：雙端測(cè)序(Paired-end)方法是指在構(gòu)建待測(cè)DNA文庫(kù)時(shí)在兩端的接頭上都加上測(cè)序引物結(jié)合位點(diǎn)，在*輪測(cè)序完成后，去除*輪測(cè)序的模板鏈，用對(duì)讀測(cè)序模塊(Paired-End Module)引導(dǎo)互補(bǔ)鏈在原位置再生和擴(kuò)增，以達(dá)到第二輪測(cè)序所用的模板量，進(jìn)行第二輪互補(bǔ)鏈的合成測(cè)序。

基因組文庫(kù)是指將某生物的全部基因組DNA切割成一定長(zhǎng)度的DNA 片段克隆到某種載體上而形成的集合?；蚪M文庫(kù)根據(jù)DNA 來源又分為核基因組文庫(kù)、葉綠體基因組文庫(kù)及線粒體基因組文庫(kù)。基因組文庫(kù)構(gòu)建時(shí)遺傳信息供體是基因組DNA,因而無發(fā)育時(shí)期及組織器官特異性，在一個(gè)*的基因組文庫(kù)中包含著基因組DNA 上的所有編碼區(qū)及非編碼區(qū)序列的克隆; 生物有機(jī)體的每一個(gè)基因在文庫(kù)中都有其克隆，該克隆的基因片段里包括著間隔序列，所以基因組文庫(kù)可真實(shí)地顯示基因組的全部結(jié)構(gòu)信息。

基因組文庫(kù)(Genomic Library)定義:把某種生物基因組的全部遺傳信息通過克隆載體貯存在一個(gè)受體菌克隆子群體中，這個(gè)群體即為這種生物的基因組文庫(kù)。

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